产品货号：
BTN130871
中文名称：
一站式MBP标签蛋白纯化套装
英文名称：
One-Stop MBP-Tagged Protein Miniprep Pack
产品规格：
20T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本产品是专门用于分离纯化MBP融合蛋白的试剂盒。
麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein，MBP)标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。
保存：RT，其中介质需4℃保存，PMSF需要-20℃保存，有效期一年。
去离子水、20%乙醇、0.22μm或0.45μm滤膜。
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麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein，MBP)标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。
- 一站式套装，含所需的直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱，操作非常方便。
- 提供2mL直链淀粉-琼脂糖介质，其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质。
- 采用麦芽糖温和洗脱，无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。
- 本介质可以反复使用多次。
| 成分 | 规格 |
| 直链淀粉-琼脂糖介质 | 2mL |
| 1M Tris-HCl(pH7.4) | 25mL |
| 0.1M EDTA溶液 | 25mL |
| 2M NaCl溶液 | 50mL |
| 蔗糖 | 20g |
| PMSF(10mg/mL) | 1mL |
| 0.1mM MgCl2溶液 | 50mL |
| 0.1M麦芽糖溶液 | 25mL |
| 层析柱(6mL) | 1支 |
| 说明书 | 1份 |
保存：RT，其中介质需4℃保存，PMSF需要-20℃保存，有效期一年。
去离子水、20%乙醇、0.22μm或0.45μm滤膜。
- 将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据MBP蛋白产量决定，其最大载量为10mg MBP蛋白/mL介质，请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中)。
- 用5倍柱体积(柱体积指的是填料介质的体积，下同)自备去离子水洗柱，共3次。
- 用5倍柱体积的新配的结合缓冲液洗柱，进行平衡，使填料介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的配方如下(以10mL为例)：
成分 用量 在结合缓冲液中的浓度 1M Tris-HCl(pH7.4) 0.2mL 20mM 0.1M EDTA溶液 0.1mL 1mM 2M NaCl溶液 1mL 200mM 自备去离子水 8.7mL - - 4℃ 5000g离心10分钟收集20mL表达菌液，弃上清，将细胞沉淀(约100mg)悬于2mL冰冷的现配的细胞洗涤液中，4℃ 5000g离心15分钟收集细胞沉淀后，再次悬于2mL冰冷的细胞洗涤液中。(最好用不加诱导物的菌液做对照样。)细胞洗涤液的配方如下(以10mL为例)：
成分 用量 在细胞洗涤液中的浓度 1M Tris-HCl(pH7.4) 0.1mL 10mM 2M NaCl溶液 0.15mL 30mM 自备去离子水 9.75mL - - 制备细胞裂解物：
- 如果所用载体不带MBP信号肽序列(如pMAL-c2)
- 超声破碎细胞，功率30 W，保持细胞低温(0℃)，直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。(超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。)
- 为使溶液澄清，向上述细胞洗涤液中加入35μL PMSF(10mg/mL)。
- 4℃下13000～15000g离心30分钟，以去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清样品，留样做SDS-PAGE电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
- 超声破碎细胞，功率30 W，保持细胞低温(0℃)，直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。(超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。)
- 如果所用载体带MBP信号肽序列(如pMAL-p2)
- 4℃ 5000g离心15分钟收集细胞，沉淀悬于1mL冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下(以10mL为例)：
成分 用量 在细胞裂解液中的浓度 1M Tris-HCl(pH7.4) 0.3mL 30mM 0.1M EDTA溶液 0.01mL 0.1mM 蔗糖 2g 20%(m/V) 自备去离子水 加水到10mL - - 加入25μL PMSF(10mg/mL)，室温搅动15分钟，于4℃ 13000～15000g离心10分钟收集细胞。
- 旋动细胞沉淀，加入2mL冰冷的0.1mM MgCl2溶液，4℃搅动10分钟。
- 休克细胞4℃ 13000～15000g离心10分钟，在上清中加入10mM Tris-HCl(pH7.4)(可将1M Tris-HCl，pH7.4稀释100倍配制而成)至pH为7.4。
- 上清用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，滤液用100倍体积的10mM Tris-HCl(pH7.4)(配方如上)4℃透析。
- 收集透析后样品，留样做SDS-PAGE电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
- 4℃ 5000g离心15分钟收集细胞，沉淀悬于1mL冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下(以10mL为例)：
- 如果所用载体不带MBP信号肽序列(如pMAL-c2)
- 将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中(保证目的蛋白与介质充分接触，以提高目的蛋白的回收率)，收集流出液。
- 用10～15倍柱体积的结合缓冲液(配方见上表)进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
- 使用5～10倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱液(即目的蛋白组分)。麦芽糖洗脱液的配方如下(以10mL为例)：
成分 用量 在麦芽糖洗脱液中的浓度 1M Tris-HCl(pH7.4) 0.2mL 20mM 0.1M EDTA溶液 0.1mL 1mM 0.1M麦芽糖溶液 1mL 10mM 自备去离子水 8.7mL - - 将纯化得到的样品(包括流出液、洗杂液和洗脱液)以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
- 填料介质清洗：依次使用3倍柱体积的结合缓冲液和5倍柱体积的去离子水平衡介质，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。
蛋白酶切割释放靶蛋白(可选步骤，所用试剂需自备) - 用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
- 加入自备的凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升介质中加入50单位的溶于1mL PBS溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2～16小时。
- 4℃以500g离心5分钟，上清小心转移到新离心管中。
- 用传统的层析方法或SDS-PAGE电泳分离靶蛋白和蛋白酶。
- 加入自备的凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升介质中加入50单位的溶于1mL PBS溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2～16小时。
| 问题 | 原因分析 | 推荐解决方案 |
| 柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 按照第10步进行介质清洗。 |
| 裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜(0.22或0.45μm)过滤，或者离心去除。 | ||
| 目的蛋白没有吸附 | 目的蛋白未表达 | 确保目的蛋白表达 |
| 样品或缓冲液中存在一些干扰因素如非离子去污剂 | 样品透析或用结合缓冲液稀释 | |
| 细胞产生大量的淀粉酶影响结合力 | 培养基中添加葡萄糖，抑制淀粉酶的表达 | |
| 融合蛋白使麦芽糖结合位点阻塞或扭曲，影响了目的蛋白的结合力 | 更换载体 | |
| 柱子结合时间太短 | 将样品与介质振荡孵育4度2小时或更长时间 | |
| 洗脱样品较杂 | 目的蛋白降解 | 加一些蛋白酶抑制剂，如PMSF、EDTA等 |
| 平衡/洗杂不充分 | 增加平衡液体积，确保介质充分平衡/洗杂，如介质太脏按照第10步进行树脂清洗 |
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